亲水色谱质谱联用同时检测 食品中多种防腐剂及甜味剂

甜味剂和防腐剂是最常用的食品添加剂，在各类食品中普遍使用。由于它们可以赋予食品更好的口感和延长食品的保质期，对食品工业的发展起了很大的促进作用。但是由于甜味剂和防腐剂很多是人工合成的，本身并不具备任何营养价值，而且可能对人体造成一定的危害，所以各国对人工合成甜味剂和防腐剂的使用都有严格的限制，不仅规定了在食品中使用的范围，并对其在各类食品中的添加量都有严格的规定。

阿力甜、纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、新橙皮苷、苯甲酸是常用的几种甜味剂和防腐剂，具有良好的水溶性，较高的极性，在反相色谱柱上保留较弱。为了提高对以上几种化合物的保留时间，本研究采用hilic色谱柱进行分离，利用超高效液相色谱-串联质谱技术进行检测，建立以上8种甜味剂和防腐剂的同时检测方法。

一、试验材料

（一）仪器

超声波清洗仪，HSC-12A；半自动固相萃取仪，美国supelco公司；waters UPLC液相色谱质谱联用仪，美国WATERS公司； hilic色谱柱，waters SB-C18 ，5μm，150mm×4.6mm；漩涡混合器，IKA MS 3；纯水仪，密理博；电子天平，MELLTER AB204-S；离心机，日立；氮气瓶； 氮吹仪，Science；均质器，莱驰；冰箱。

（二）试剂及溶液

纽甜标准品； 阿力甜标准品； 阿斯巴甜标准品； 安赛蜜标准品； 甜蜜素标准品； 新橙皮苷标准品； 糖精钠标准品； 苯甲酸标准品； 甲酸，色谱纯； 甲酸铵，分析纯； 甲醇，色谱纯； 乙腈，色谱纯； 正己烷，色谱纯。

二、试验方法

（一）样品提取

液体样品直接量取2mL于20mL容量瓶中，并加入50%的甲醇水溶液定容至20mL，1000转/分涡旋混匀2分钟，静置10分钟，4℃以5000rpm离心10分钟，取1mL加入玻璃管中，再往其中加入9mL的乙腈。固体样品称取2.0g已制备好的样品于50mL离心管中，加入50%的甲醇水溶液， 1000转/分涡旋混匀2分钟，静置10分钟，4℃以5000rpm离心10分钟，取1mL加入玻璃管中，再往其中加入9mL的乙腈。玻璃管置40℃水浴中氮吹至近干，加水定容至1mL，将定溶液吸入1.5mL离心管中，10000rpm离心5min，取上清液上机测定。

（二）仪器条件

流速：0.3mL/min；柱温：25℃；色谱柱：waters AMINDE BEH SB-C18 ，1.7μm，100mm×2.1mm ；进样量：5μL；ESI+源:毛细管电压3.00kV，脱溶剂气650L/H,脱溶剂温度350℃，锥孔气60L/H；ESI-源: 毛细管电压1.50kV，脱溶剂气650L/H,脱溶剂温度350℃，锥孔气60L/H；扫描方式：MRM,正负离子同时扫描；流动相：A为pH5.0含10mM甲酸铵的50%乙腈水溶液，B为含10mM甲酸铵90%乙腈水溶液；梯度洗脱程序为： 

表1梯度洗脱程序

 

 

 

 

 

 

 

 

质谱的MRM条件如下表：

表2质谱的MRM条件

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

（三）标准曲线的绘制

用100mg/kg的储存标准溶液，以90%的乙腈水溶液稀释成六个浓度的标准溶液，置于进样瓶中，将配置的系列标准工作液从低浓度到高浓度依次注入仪器检测，根据浓度～峰面积作标准曲线。各化合物的标准系列见下表：

表3各化合物的标准系列（见下页）

（四）回收的测定率

取2.0g空白的样品，准确加入合适浓度的标准品溶液，制成不同浓度的添加样品，按照上述的提取程序进行操作。

表4各标准品添加浓度（见下页）

（五）精密度的测定

取2.0g空白样品，添加合适浓度的标准液，使添加的浓度与上表一致，每个浓度做六个平行。经液相色谱质谱联用仪测定，比较每个平行样品间测定的浓度的变化幅度，计算每组的相对标准偏差。

表3各化合物的标准系列

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表4各标准品添加浓度

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

（六）检测限

取空白样品，加入适量的标准溶液，制成低浓度添加剂含量的样品，按样品处理程序处理后测定，将引起3倍基线噪音的添加剂浓度定义为最低检测限。

三、结果与讨论

（一）样品溶剂的选择

与反相色谱柱相反， hilic色谱柱在流动相含高比例有机相时具有高的保留能力，流动相含高比例水相时保留能力弱。所以在样品溶剂选择时，应尽量提高样品溶剂的有机相比例，以避免导致较强的溶剂效应，引起待分析化合物峰形变差。实验表明在采用50%乙腈水溶液作为溶剂时，溶剂效应非常明显，导致化合物保留时间缩短，提前出峰，部分化合物的峰形变宽、拖尾，灵敏度降低（见图1）。当提高溶剂的有机相时，溶剂效应可以明显降低，在溶剂的有机相达到90%时，溶剂效应已经基本不明显，化合物的峰形变好，化合物的保留时间也得到增加（见图2）。因此考虑到化合物的溶解性，最终采用90%的乙腈水作为溶剂。

   

 

 

 

 

 

图1                       图2

（二）质谱条件的优化

由于安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、甜蜜素，只能产生带负电的离子，因此只采用负离子模式对其质谱参数进行优化。而对纽甜、阿力甜、阿斯巴甜和新橙皮苷四种化合物采用正、负离子两种模式进行优化，通过实验发现新橙皮苷的负离子模式比正离子模式具有更高的响应，而纽甜、阿力甜、阿斯巴甜正离子模式比负离子模式的响应更好。因此对安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、甜蜜素、新橙皮苷采用负离子模式进行检测，而纽甜、阿力甜、阿斯巴甜三种化合物采用正离子进行检测。每种化合物均选取了两个子离子，一为定量离子，一为定性离子。但是苯甲酸由于只能产生一种子离子，因此没有选取该离子作为定量离子。

（三）色谱条件的优化

与反相色谱类似，多种参数决定了HILIC保留行为，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。但影响保留行为的最主要因素是流动相中有机相的比例，如流动相中乙腈的含量过低，水含量较高，会显著增加流动相的洗脱能力，使化合物保留时间大大缩短。而流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐会影响化合物的峰形以及响应值。本研究重点对缓冲盐、流动相缓冲体系的pH值以及洗脱方式进行了优化。

从实验结果可以看出，在没有缓冲盐和不调节流动相的pH值时，阿力甜和阿斯巴甜拖尾比较明显（见图3）。通过在流动相中添加了10mM的甲酸铵溶液，并且将水相（含50%的乙腈）的pH调至5.0，这两个化合物的拖尾受到明显的抑制，峰形也变得尖锐（见图4）。其它几种化合受pH影响要小很多，在pH改变后，保留时间和峰形的变化不明显。

   

 

 

 

 

 

 

图3                           图4

对流动相的优化主要是将有机相从纯乙腈变为含10mM的甲酸铵的95%乙腈水溶液，水相由纯水变为含10mM的甲酸铵的50%的乙腈水溶液（pH5.0）。通过改变这两个条件，可以看出化合物的分离度得到了改善，同时增加了纽甜、阿力甜和阿斯巴甜以及苯甲酸、新橙皮苷的保留时间（见图5和图6）。

   

 

 

 

 

 

 

图5                           图6

（四）检测限

不同的化合物检测限相差很大，安赛蜜和纽甜的检测限较低可以达到0.025mg/kg，甜蜜素的检测限为0.063mg/kg，糖精钠的检测限为0.25mg/kg，阿力甜的检测限为0.45mg/kg，阿斯巴甜的检测限为0.375mg/kg，新橙皮苷和苯甲酸的检测限较高达到0.5mg/kg。

（五）回收率

从下表中可以看出在化合物各自对应的三个浓度下,在果汁中阿力甜的回收率在73.2~78.5%之间，纽甜的回收率在79.3~85.1%之间，阿斯巴甜回收率在77.5~81.3%之间，安赛蜜回收率在72.6~76.3%之间，甜蜜素回收率在68.4~73.5%之间，新橙皮苷回收率在72.6~74.3%之间，糖精钠收率在68.3~77.1%之间。在果脯中，阿力甜的回收率在73.2~78.5%之间，纽甜的回收率在79.3~85.1%之间，阿斯巴甜回收率在77.5~81.3%之间，安赛蜜回收率在72.6~76.3%之间，甜蜜素回收率在68.4~73.5%之间，新橙皮苷回收率在72.6~74.3%之间，糖精钠收率在68.3~77.1%之间

表5 添加剂在果汁中的回收率

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表6添加剂在果脯中的回收率

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

（六）精密度

从下表中可以看出在各化合物对应的三个浓度下, 阿力甜的精密度在3.1~5.2%之间，纽甜的精密度在5.1~6.2%之间，阿斯巴甜精密度在2.8~5.0%之间，安赛蜜精密度在3.7~4.3%之间，甜蜜素精密度在2.5~3.2%之间，新橙皮苷精密度在3.7~6.2%之间，糖精钠在3.7~4.3%之间，糖精钠精密度在3.5~4.3%之间，苯甲酸精密度在3.3~4.1%之间，八种色素均具有较好的精密度。

表7添加剂的精密度（见右上）

四、结语

本方法具有灵敏度高、重复性好的特点，适用于阿力甜、纽甜、阿斯巴甜、甜蜜素、安赛蜜、糖精钠、新橙皮苷、苯甲酸8种甜味剂和防腐剂的同时测定。

表7添加剂的精密度

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献

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