基金项目：安徽省教育厅自然科学研究重点项目（KJ20180471）“基于二级食物链水平环境因子作用下的纳米银毒性效应研究”。
摘 要：纳米银颗粒 ( silver nanoparticles, AgNPs )在环境中的生态毒性仍不清楚。本文利用大肠杆菌到秀丽隐杆线虫二元食物链模型评价环境因子富里酸（the fulvic acids, FA）对AgNPs沿食物链传递后毒性影响。本研究结果显示环境有机质FA可促进纳米银颗粒沿食物链传递后的生态毒性显著增大，如生殖腺细胞凋亡数目显著增加、生殖腺有丝分裂区细胞数目明显减少、子代数目明显降低、寿命亦明显缩短。结果表明在生态系统中，环境相关因素对纳米材料沿食物链传递后所产生的毒性有显著影响。
关键词：AgNPs；富里酸；食物链；秀丽隐杆线虫
1、前言
Caenorhabditis elegans是一种广泛分布在土壤生态系统中线虫属，并且在营养循环中起着重要作用。尤其重要的是，C. elegans 作为一种模式实验生物，被广泛应用在纳米毒理学和生态毒理学研究中[1-3]，通体透明便于直接观察AgNPs 在体器官中的分布。此外, 大肠杆菌- Escherichia coli作为C. elegans 通常的食物能够累积AgNPs[4]。因此, 它也是评价AgNPs累积和毒性的一个极好的食物链模型。利用此二元食物链模型，我们得出AgNPs 在E. coli 有显著的累积作用，并传递给较高营养级生物有机体C. elegans 。而且，AgNPs 处理的 E. coli 对C. elegans 有显著地毒性作用, 研究表明AgNPs 干扰了生殖腺细胞凋亡、减少了子代数目和线虫的寿命。尤其重要的是，富里酸 ( the fulvic acids, FA ), 在复杂的环境生态系统是无处不在的，可能会改变环境中AgNPs 的行为，在食物链中，有效地促进AgNPs 在E. coli 中累积及对C. elegans 产生毒性效应。本研究结果揭示了释放到环境中的AgNPs，通过食物链传递，威胁着人类健康，且环境中FA也是一个重要的影响因素。
2、材料和方法
2.1 AgNPs 和 AgNPs-FA悬浮液的准备
商业化AgNPs粉体，粒径小于 100 nm，聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP )涂层作为分散剂，AgNPs和富里酸 ( Fulvic acid，FA ) 均购自Sigma-Aldrich (中国)公司。准备FA 储存液：将1 g FA溶解在1L 超纯水中，室温下用转子搅拌过夜，于超净工作台下，用0.22 μm微孔滤膜过滤。AgNPs 和 FA (AgNPs-FA) 共作用的混合液按照1 g/L 的 AgNPs与 10 mg/L FA 共作用 5 d ，从而达到较稳定的动态平衡状态。AgNPs 和 AgNPs-FA 储存液 (1 g/L) 依靠超声波处理30 min，而得以均一分散在去离子水中。
2.2 C. elegans 培养条件
从线虫遗传中心 ( Caenorhabditis Genetis Center，CGC) (University of Minnesota, USA) 获得的C. elegans (N2 Bristol 野生型品系) 被保种在我们实验室，保持在20 °C、表面铺有作为食物源的活的Escherichia coli OP50标准的线虫生长介质 ( Nematode growth medium，NGM )。培养线虫的所有操作均按照标准程序进行。
2.3 用AgNPs 和 AgNPs-FA对E. coli进行处理后通过食物链暴露C. elegans
为了探索AgNPs 在食物链的摄入与传递，我们设计出使用C. elegans 和作为C. elegans食物源的E. coli - OP50 二元简单无脊椎动物食物链模型。首先，挑取单克隆E. coli OP50菌斑培养在容纳有5 mL LB介质的锥形瓶中，置入培养箱中，35 °C，200 rpm 过夜活化；然后吸取200 μL 过夜培养的E. coli 菌液滴加到含有不同浓度的AgNPs 或 AgNPs-FA (0, 1, 5, 10 mg/L) 10 mL LB介质中，在37 °C、12 h、200 rpm 条件下培养；暴露培养12h 后，将处理后的E. coli 使用离心机在4 °C、5000 rpm、5 min 条件下离心，用高温灭菌去离子水离心水洗3次；最终收集的浓缩菌液被重新悬浮在1mL去离子水中，此后，取100 mL 被1mL去离子水稀释的E. coli 菌液滴加在培养碟(直径35 mm 培养皿)中盛放的NGM固体培养基表面、铺平。在超净工作台下、20 °C通风30 min 晾干。然后，挑取C. elegans 放在接种有使用AgNPs 或 AgNPs-FA暴露处理的E. coli 菌面上，在20 °C 温度条件下培养，直到毒性检测试验结束。
2.4 使用生殖腺细胞凋亡、生殖腺有丝分裂区细胞数目、子代数目和寿命等生物学终点评价AgNPs 毒性效应
2.4.1 生殖腺细胞凋亡实验
用吖啶橙(Acridine orange，AO) (AO, Sigma)对C. elegans进行染色检测生殖腺细胞凋亡。被AgNPs 或 AgNPs-FA暴露处理后的E. coli，作为秀丽隐杆线虫的食物暴露给50 - 60条L4 期幼虫；20 °C黑暗中培养24 h后，线虫被移入浓度为500 μL AO溶液中，20 °C黑暗中染色1h；然后，将染色后的线虫挑在新的NGM培养皿中的菌坪上恢复40 min，用铂丝将菌坪上恢复后的线虫移入载玻片上叠氮化钠溶液中，盖上盖玻片，于Olympus IX71荧光显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)下，观察计数AO染色呈阳性的凋亡细胞尸体。
2.4.2 评测有丝分裂期生殖腺细胞
Craig等人对C. elegans生殖腺有丝分裂期细胞数目评测程序已有报道，我们对其进行了适当的调整，并已有相应的文章刊出。首先，使用1 μg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在避光条件下将虫体切开曝露出的生殖腺染色10 min，然后，用PBST ( PBS 和 0.1% Tween-20 ) 5 min 洗3次，接着使用粘裱液 (pH 8.0, 90% 甘油, 20 mM 三羟甲基氨基甲烷和 1 mg/ mL 对苯二胺混合物)将生殖腺固定在载玻片上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片边缘粘合封口；于 Olympus IX71 荧光显微镜下计数生殖腺有丝分裂区( 从远端细胞大约20个细胞的距离 ) 细胞数目。
2.4.3 子代数量实验
将AgNPs 或 AgNPs-FA暴露处理的 E. coli喂给野生型C. elegans L1期幼虫，直到L4期后，每天将虫子转到新的铺有暴露处理的培养皿中培养，直到线虫停止产卵；移去线虫的培养皿，经过24h 后，于解剖镜下计数培养皿中刚孵化不久的幼虫数目，将产卵期每天计数的单个母体所产幼虫总和起来就是一个处理线虫的子代数目。
2.4.4 寿命实验
将AgNPs 或 AgNPs-FA暴露处理的 E. coli作为线虫的食物源，相同的实验程序使用于线虫寿命实验。每天线虫被转入新的NGM培养皿中，在NGM培养基上均已铺有AgNPs 或 AgNPs-FA暴露处理的 E. coli，直到产卵结束，然后每隔3天转换一次培养皿，每天检查一次线虫的死亡数目，使用铂丝轻触线虫的身体，如其没有任何反应可视其已经死亡。
2.5 数据统计
所有结果均以平均值 ± 标准误表示。使用单因素方差分析(One-way ANOVA) 将对照组与其他任意一组分析平均差，使用双因素方差分析(Two-way ANOVA)分析不同处理组间的平均差。统计学上具有显著意义的评判标准是p < 0.05。
3、结果
3.1 在食物链中，FA影响了AgNPs诱导C. elegans生殖细胞凋亡
C. elegans生殖细胞凋亡实验结果如图 1显示，与对照组减数分裂区生殖细胞凋亡数目相比，浓度为5和25 μg/ml的AgNPs与AgNPs-FA通过食物链传递诱导了C. elegans生殖腺细胞凋亡，且FA作用后的AgNPs通过食物链传递给C. elegans后，显著增加了凋亡的生殖细胞数目。
图 1 AgNPs通过食物链传递诱导C. elegans生殖腺细胞凋亡及FA产生的影响。
注：(A)，为对照组C. elegans身体后半段图片，白色箭头指示减数分裂区凋亡的生殖细胞；(B)，10.0 μg/mL AgNPs通过食物链传递后对C. elegans暴露24h，亲本的生殖腺细胞凋亡；(C)，浓度为1.0、5.0和10.0 μg/mL的AgNPs与AgNPs+FA通过食物链传递后对C. elegans暴露24h，亲本的生殖腺细胞凋亡。*表示与control比，p<0.05；#表示AgNPs+FA与AgNPs相比，p<0.05，以下同。
3.2 在食物链中，AgNPs抑制C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞增殖
为了探索AgNPs诱导C. elegans生殖细胞凋亡的可能原因，我们检测了经食物链暴露处理后C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞数。结果如图 2所示，AgNPs通过食物链传递抑制C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞增殖，且在FA的作用下，AgNPs的抑制作用明显增强，即与未用FA处理组相比，C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞数目显著减少。
图 2 AgNPs通过食物链传递抑制C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞增殖及FA产生的影响。
注：(A)为对照组C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞，经DAPI染色后的图片；(B)为10.0 μg/mL AgNPs通过食物链传递后C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞，经DAPI染色后的图片；(C) 柱状图显示浓度为1.0、5.0和10.0 μg/mL的AgNPs与AgNPs-FA通过食物链传递后C. elegans生殖腺有丝分裂区细胞数。刻度尺长度20μm。
3.3在食物链中， AgNPs导致C. elegans子代数量明显减少
通过对AgNPs与AgNPs+FA暴露处理的C. elegans子代数量生物学终点实验。结果如图3所示，在1.0、5.0和10.0 μg/mL剂量条件下，暴露处理组线虫的子代数呈现剂量依赖式的降低，而FA促进了这一下降趋势。
图3比较FA对AgNPs经食物链传递后的子代数量的影响。
注：每一个暴露剂量组20条 C. elegans，每24 h分别转到一个新的培养皿中，直至停止产卵，待其孵化后，计数每一条亲本产下的所有幼虫数量。该实验实行三次重复实验。
3.4 在食物链中， AgNPs导致C. elegans寿命明显缩短
通过对AgNPs与AgNPs+FA暴露处理的C. elegans寿命实验，检测AgNPs与AgNPs-FA通过食物链传递后的毒性效应。结果如图4所示，在1.0、5.0和10.0 μg/mL剂量条件下，暴露处理组线虫的寿命明显缩短，且呈剂量依赖式效应，FA促使毒性效应明显加强。
图4比较FA对AgNPs经食物链传递后寿命的影响。（见下页）
注：将C. elegans培养在盛有NGM培养皿中，NGM上铺有经AgNPs暴露处理的E. coli。每天计数每组活的与死的线虫数量。通过C的存活曲线，计算每个剂量组60条线虫的平均寿命。实验执行三次重复。
4、讨论
生殖腺细胞凋亡实验是一个极好的毒性检测终点，我们的研究团队利用此生物学检测终点评估了许多环境污染物的遗传毒性。研究结果表明， AgNPs被E. coli 携带传递给了C.elegans，并且诱导了C. elegans生殖腺细胞凋亡，同时，环境因子FA显著影响了AgNPs的毒性效应。结果表明AgNPs通过食物链对C. elegans产生毒性效应，而在FA的作用下，AgNPs毒性效应明显增强。
图4比较FA对AgNPs经食物链传递后寿命的影响。
关于线虫的生活史，包括子代数量、种群增长规模、寿命，所有这些参数均随着食物的数量与质量或者环境胁迫条件的变化而受到影响[5-6]。 已有研究表明AgNPs 分布在无脊椎动物的胚胎中，并干扰了胚胎发育[7-9]。也有一些关于NPs对C. elegans的纳米毒性研究，结果表明纳米颗粒可以通过渗透进入生殖腺，可能传递给下一代，并对下一代的胚后期的发育产生潜在的毒性作用[2, 10, 11]。对于C. elegans发育来说，生殖是潜在毒性影响的一个极好的检测指标，为了探索AgNPs 通过食物链传递作用对C. elegans胚胎胎儿发育的潜在影响，我们分析了细胞周期阻滞及子代数量。在本研究中，结果如图2显示, C. elegans在喂食了AgNPs处理后的E. coli，其有丝分裂区细胞数目指标显著下降，并且呈现出剂量依赖效应，FA严重影响了这一结果。此外，类似地C. elegans在喂食了AgNPs处理后的E. coli，其子代数量指标也显著下降，同样具有剂量依赖效应 (图3)。
C.elegans寿命也被引进来作为一个有用的毒理学研究终点[12]。为了探索AgNPs 对C.elegans寿命影响的毒性效应，不同浓度的AgNPs暴露处理的E. coli喂给线虫，结果如图4显示，10.0 mg/L AgNPs暴露处理的E. coli喂食的线虫，与对照组相比，其平均寿命下降了45%；而在FA的影响下，其平均寿命下降了55%。已有研究报道，AgNPs对C. elegans的毒性作用是其直接作用于线虫导致的，而并非是通过食物源大肠杆菌传递产生的[13]。因此，我们推断AgNPs 对 C. elegans 产生的所有毒副作用是AgNPs通过食物链在线虫体内的累积直接引起的，而环境因子FA有效地增加了AgNPs在C.elegans体内的累积。富里酸（FA）和腐殖酸（HA）是天然有机质（NOM）中极小的颗粒，两者的主要区别是FA负责运输溶液中的杂质颗粒及HA负责捆绑溶液中的杂质颗粒。我们还观察到在食物链中FA促进了细菌对AgNPs 摄入与运输。总之，环境因素可能会对AgNPs生态毒性产生潜在的影响。
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作者简介
罗勋（1972-），男，安徽凤阳人，淮南师范学院生物工程学院副教授，博士。
