以造纸废水为原料的初始pH值对混合菌合成PHA的影响

1、引言

聚羟基烷酸酯是一种胞内聚合物，可作为微生物的碳源、能量或还原当量[1]。其物理性能与聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)等材料相似，但其优越的可生物降解性、热塑性、疏水性及低透气性使其成为一种极有前景的石油化工塑料的替代材料[2, 3]。目前，工业生产PHA的主要途径是利用纯菌发酵培养系统实现的，因其严苛的培养条件及复杂的控制过程，而大大增加了PHA的生产成本[1]。所以，当前的PHA市场价格跟传统塑料相比没有竞争力，这阻碍了PHA作为环保新材料的广泛运用。另一方面，研究表明活性污泥包含的极其复杂的微生物群体在废水生物处理过程中具有合成PHA现象。因此，利用活性污泥处理有机废水生产PHA，不仅可以实现有机废水的处理及资源化，并且可以大大节约PHA生产成本。

一般来说,PHA的合成采用三段式工艺[1, 4-6]包括废水/废弃物厌氧发酵产酸、产PHA贮存细菌的筛选富集及批示反应器中的PHA累积生产。在第一步生产过程中,以废水/废弃物为原料，譬如，剩余污泥[7, 8]、造纸废水[9]、蔗糖废水[10]、橄榄油废水[11]等，通过厌氧消化过程产酸,将废水/废弃物中的碳水化合物转换为易于微生物吸收转化的挥发性脂肪酸（VFAs）；在第二步过程中，混合菌采用饱食-饥饿方法筛选、富集培养具有高PHA贮存能力的贮存细菌；在第三阶段,通常是在限营养（氮，磷）条件下进行PHA的累积生产，限营养条件有利于PHA的贮存是因为限制了微生物的生长使得投入的外加碳源向贮存过程有更高的转化效率。 

关于第3步生产PHA（PHA累积步骤）的过程，很少的研究报道描述pH对PHA累积生产的速率及效率的影响[4, 12, 13]。按照上述报道的发现，似乎当pH控制在8-9而不是6-7范围内时有更高的PHA生产速率。再者，有研究表明第二步与第三步控制的pH值不同影响PHA的生产速率及组分[13, 14]。特别的，他们的研究结果表明碱性条件（pH值7.5-9.0）有利于PHV的生成并且有更快的PHA合成速率[13, 14]。然而，上述的研究都是将pH控制在一定确定值实现的。相较于pH过程控制，仅控制初始pH的过程设计更简单、便宜[5]。此外，在工业实际运用中，仅控制初始pH的方式比过程控制pH的方式有更低的酸碱药剂的投加，这将有利于降低PHA的控制成本。

初始pH控制策略相比pH过程控制策略是一种更简便、成本更低、更适用于实际操作的pH控制方法。选取造纸废水为研究对象，确定最佳的初始pH探索这一pH控制方法将对对造纸废水的处理与PHA合成与应用推广有很重要的意义，同时也为其他废水或废弃物进行PHA生产提供一些参考。为调查造纸废水发酵液初始pH对混合菌合成PHA性能的影响，本研究设计选取pH在6.5-8.5范围内的4个不同初始pH值。

2、材料与方法

2.1 实验设置

实验过程中的污泥来自实验室PHA贮存细菌富集反应器稳定过程的饱食末期，用微量元素混合液淘洗污泥3次洗去污泥表面附着的基质及微生物排泄物等，然后将污泥空曝（饥饿）超过12h尽可能消耗掉胞内贮存的PHA。上述预处理后的污泥可用于实验。实验发酵液来自实验室稳定后的厌氧发酵产酸的SBR反应器。造纸废水发酵液初始pH对PHA合成的影响实验，在六联搅拌仪（HJ-6A数显恒温磁力加热搅拌器，宁波）中进行。具体的实验操作步骤如下：

（1）实验启动：量取370mL造纸废水发酵液与130mL活性污泥（此时混合的总VFAs浓度约为139.1Cmmol/L，包括乙酸69.6Cmmol/L，丙酸66.9Cmmol/L及少量丁酸2.6Cmmol/L）于4个500mL的烧杯中，再加入1毫升ATU来抑制硝化细菌的活动。加入磁力搅拌转子，设置恒温为30℃，将启动曝气机与曝气机相连的曝气头伸入烧杯底部（注意勿使曝气头与转子碰撞），保证反应过程中的溶解氧充足。启动六联搅拌仪。

（2）调节pH值：使用0.5mol/LH2SO4及0.5mol/L NaOH来进行初始pH调节，实验设计将四组造纸废水发酵液与活性污泥混合液的初始pH值分别调节为6.20、7.10、7.90及8.60，而实际操作过程中，初始pH值与设计值稍有差异，分别是6.22、7.17、7.93和8.60。

（3）pH值与DO的测量与记录：每隔15分钟，使用便携式pH计及DO仪（梅特勒，上海）记录各组混合液中的pH值与DO浓度。

（4）样品收集：每隔30分钟取混合样，污泥样用于PHA、MLSS与MLVSS的测定，水样主要用于VFA的测试。

本论文在实验中设置不同的造纸废水发酵液与活性污泥的混合液初始pH值条件，对实验过程中的pH及DO进行监测，并间歇取样用于VFA、PHA以及污泥浓度等的测量。通过研究造纸废水发酵液初始pH值对混合菌合成PHA的影响，确定造纸废水发酵液最佳初始pH值，以及得出其它相关结论。

2.2 测试方法

实验过程中涉及到的主要测试指标如下述。TSS、VSS、DO、pH水质指标测试根据《水和废水监测分析方法》（第四版）[15]分析测试方法来测试。采用气象色谱法对挥发性脂肪酸（VFA）进行测试（岛津GC-2010plus），方法参考[7]。以苯甲酸为内标物进行聚羟基脂肪酸（PHA）的测试，测试仪器采用气相色谱仪（岛津GC-2010plus），方法参考[16]。

2.3 计算方法

生物质（Biomass concentration，X）通过VSS与PHA的差值来计算, X =VSS-PHA。PHA(%) =PHA (mg/L) / VSS(mg/L)。活性生物质从g/L转化为Cmol/L，依据生物质的分子式CH 1.8O0.5N0.2，则转化系数为24.6 g/Cmol [17]。 聚羟基丁酸（PHB）浓度单位从g/L换算成Cmol/L，假设PHB的分子式为CH1.5O0.5, 则转化系数为21.5 g/Cmol[18]，同理，聚羟基戊酸（PHV）的分子式为CH1.6O0.4，则转化系数为20 g/Cmol。

3、结果与讨论

3.1 不同条件下DO及pH值的变化

如图1a所示，4组不同初始pH条件下的DO均呈现先下降，之后有一个突然上升的现象，最后逐渐趋于平稳。在PHA生产过程中，无法对PHA的浓度进行在线监控，通常采用间接手段对贮存过程进行控制。DO信号常被用来作为指示贮存过程终点的信号，DO信号陡增预示着基质消耗完全、PHA贮存达到最大[19, 20]。图中观察到，pH值为6.22、7.17、7.93及8.60条件下的DO突然上升时刻分别是在225min，195min，165min及225min，这些陡然上升时刻点也暗示着不同条件下的PHA贮存达到最大贮存含量的时刻是不一样的。

如图1b所示，初始pH值为6.22时，混合液的pH值快速从6.22增加至8左右，然后逐渐趋于稳定至8.15左右；初始pH值为7.17时，混合液的pH值快速从7.17增加至7.7左右，然后逐渐趋于稳定至8.25左右；初始pH值为7.93时，混合液的pH值开始时略有下降，下降至7.75，然后开始缓慢增加至8.16，最后逐渐趋于稳定至8.23左右；初始pH值为8.60时，混合液的pH值开始下降至8.06，然后开始缓慢增加逐渐趋于稳定至8.25左右。初始pH为6.22和7.17的pH变化趋势为逐渐上升，且造纸废液在投加之初上升幅度较大，后逐渐趋于平稳；初始pH为7.93的变化趋势是先有一个快速下降过程然后再上升；初始pH为8.60变化趋势为快速下降，下降速度逐渐降低，然后缓慢上升趋于平稳。同时观察到，4组不同条件下pH值变化速率都在减小，即pH值起始阶段变化速度较快，随后的变化变慢，最后逐渐趋于平稳至8.20左右。

图1 不同初始pH值条件下PHA贮存过程中（a）DO及（b）pH变化曲线图

依据Guisasola等（2007）[21]的报道，微生物好氧生化过程中引起pH变化的原因包括：基质吸收、CO2缓冲体系的影响及氨氮吸收的影响。本实验是在限营养的条件下进行的，所以不存在氨氮吸收对pH变化的影响。剩下两部分引起pH变化的等式如下，

基质吸收：HA         H++A-

                                                                            pkc1                     pkc2

CO2缓冲体系：CO2+H2 O   ■ H2 CO3   ■  H++HCO3  ■H++CO2-3

本研究涉及到的基质是乙酸、丙酸及少量丁酸，饱食期基质的吸收会消耗质子从而导致pH的上升。CO2缓冲体系包括生化过程中的CO2产生会导致pH的下降，而搅拌过程中会排出液相中的CO2从而使pH上升。查询电离常数资料可知，乙酸及丙酸的pKa值分别是4.757、4.874，碳酸盐缓冲体系的pka1为6.38，pka2为10.25。而本研究PHA贮存过程中的pH值变化范围在6-9内，因而乙酸、丙酸等脂肪酸酸缓冲能力对贮存过程中pH变化的影响较小，pH变化的主要影响因子是体系中CO2的变化。

3.2 不同初始pH值条件下的PHA合成量

如图2，四组不同初始pH值条件下，观察到VFA均呈现明显的下降趋势，而PHA的贮存量及PHA在生物质中的含量呈现不断上升的趋势。初始pH值为6.22,7.17，7.93和8.60条件下达到最大PHA贮存效果的时刻分别是225min、195min、165min及225min，与3.1中DO的跃迁时刻一致，暗示DO能够很好的预测PHA的最大贮存时刻。这一最大时刻点预示着基质基本消耗完全，图2中也可以观察到对应时刻点的VFAs浓度为0。此时，PHA的最大贮存浓度分别是86Cmmol/L、96.67Cmmol/L、99.42Cmmol/L及54.73Cmmol/L ，在生物质中的含量分别为65.3%，67.1%，68.5%和53.8%。从PHA的贮存含量来看，初始pH为7.93时有最大PHA合成含量，而初始pH为8.60时PHA的含量最低。从动力学角度来看，初始pH值设定为7.93时，VFA的平均消耗速率最大为0.85Cmol/(L·min)，PHA的贮存速率最大为0.60Cmol/(L·min)。也就是说，四组实验条件下无论是从贮存效果还是从贮存速率来看，初始pH值设定为7.93条件下有最优的PHA贮存。

 

图2 不同初始pH条件下的PHA贮存过程中的VFAs、PHA及PHA%含量的变化，（a）初始pH值为6.22（b）初始pH值为7.17，（c）初始pH值为7.93，（d）初始pH值为8.60

Kourmentza等[5]在研究初始pH值对合成PHA合成的影响时，设置了四组初始pH值不同的实验（分别为6.40、6.90、7.25、7.50），结果表明，初始pH在6.90时，能得到最大的PHA合成量。6.22,7.17，7.93和8.60本实验结果认为初始pH在6.93时有最优的PHA合成效果，改结果与Kourmentza等[5]的结果不同，可能是Kourmentza等的实验初始pH范围设定更窄在6.4-7.5之间，而本实验初始pH范围设置在6.2-8.6之间。另一方面，使用的碳源也不一样，Kourmentza等使用的碳源为1:1:1的乙酸、丙酸、丁酸混合脂肪酸，而本实验使用的是造纸废水发酵液，含有接近1:1的乙酸、丙酸，另外含有非常少量的丁酸。刘一平等[3]通过设置三组不同pH值分别为7、8.5和10，结果表明当pH =8. 5时，PHA 含量最高。整体来看，微偏碱性的初始pH更利于PHA的合成。

Serafim等[12]则发现生产过程中调节pH值为 7.0 时PHA含量仅为 27.5%，pH值为 8.3 时含量也仅提高到39.8%，都比不控制pH值时47.5%的PHB含量低，因此认为不控制pH值或保持弱碱性pH值能够提高PHA产量。若从整体工艺运行和经济效益来考虑，不控制pH值将减少过程控制的复杂性和降低运行成本，因此在后续的很多研究并没有对生产过程中的pH值进行调节，而是通过微生物的生化作用自动将pH的范围最后调节在8-9[12, 22]。

Chua等[4]发现驯化阶段pH值在7～8范围内时污泥合成PHA能力不受影响，但在序批实验中pH值对PHA合成的影响可解释为：低pH值条件下，乙酸以非离子态存在于体系中，未离解的乙酸很快被微生物吸收，并在细胞中离子化，产生的质子负荷使胞内环境pH值降低，不利于PHA的合成。此外，认为不合适的pH值范围抑制了微生物细胞活性，主要原因可能是pH值影响了微生物细胞内酶的活性。过高或者过低的pH值会导致酶的高级结构发生改变，而本实验中，在初始pH值为8.6时，所有反应的速率都在下降，推测是过高的pH值情况下，导致了酶活性大大下降从而抑制了PHA的合成效果。

3.3 不同初始pH条件下PHV的组分含量

如图3，柱状图中给出了不同初始pH条件下饱食末期时PHV的合成量，发现随着初始pH值的上升，PHV合成量逐渐下降，这表明高pH值不利于PHV的贮存。当pH为6.22时，可以得到最高的PHV合成量，为36.61Cmol/L，此时PHV在总的PHA中的占比为42.8%。本研究将PHV的含量特别的进行说明，是因为单纯的PHB产品较脆不利于后续的利用，而在PHA产品中掺杂PHV可以很好的解决PHB产品较脆的缺点[1]。

图3 不同初始pH条件下最大PHA贮存含量时的PHB、PHV及PHV在总PHA中的占比图

林东恩等[23]分别使用乙酸钠和丙酸钠培养活性污泥，结果表明，以乙酸钠培养的活性污泥所得到的PHA样品组成以PHB为主，PHB：PHV比例为93.91：6.09；以丙酸钠培养的活性污泥所得到的PHA样品组成主要以PHV为主，另外还有少量PH2MB与PH2MV，四种PHA的比例为28.66:63.13:2.55:5.66。所以以丙酸盐为碳源所得到的PHV比例比以乙酸盐为碳源所得到的要高出很多。秦清等[24]在研究单一碳源对PHA合成的影响时，采用乙酸、丙酸、丁酸3种不同碳源培养活性污泥，结果表明以乙酸和丁酸作为碳源时，PHB占比高于97%，以丙酸为碳源时，PHV占比为81.20%。也可得到以丙酸为碳源有利于提高PHV占比的相同结论。

以上的研究成果都表明，对PHA合成组分影响的关键因子是丙酸盐基质及其转化物。所以pH值对PHA合成组分影响最有可能的原因是，pH值通过影响碳源转化路径继而间接影响了PHA的组分。在PHA合成途径中，丙酸盐会转化为丙酰辅酶A,丙酰辅酶A可能会转化为乙酰辅酶A，在丙酰辅酶A转化为乙酰辅酶A时，会脱去一分子CO2[13]。本研究的结果是微碱性的初始pH条件更利于PHA的合成，可能是在碱性条件下更有利于丙酰辅酶A转化为乙酰辅酶A转化这一过程的发生。由于PHV的合成同时需要丙酰辅酶A转化物与乙酰辅酶A转化物[1]，而丙酰辅酶A含量相对于乙酰辅酶A含量而言是较少的。所以，更高的丙酰辅酶A含量有利于PHV的形成。所以，当pH值升高时，丙酰辅酶A更多地转化为乙酰辅酶A，不利于PHV的形成。

4、结论

本论文通过设置四组不同的造纸废水发酵液的初始pH条件的实验（四组初始pH值分别为6.22、7.17、7.93、8.60），研究造纸废水发酵液初始pH值对合成PHA的影响，结果表明当造纸废水发酵液初始pH值为7.93时，通过活性污泥利用造纸废水发酵液合成PHA得到最大PHA合成量为99.42Cmmol/L，含量为68.5%。随着造纸废水发酵液初始pH值的升高，PHV合成量在持续下降，在总PHA中的占比下降。当初始pH值为6.22时，PHV有最大合成量，为36.61Cmmol/L，占总PHA比例最高为42.8%。造纸废水发酵液最佳初始pH的确定，初始pH值控制是利用造纸废水发酵液合成PHA技术有了一种操作更简便、成本更低、更适用于实际操作的pH控制方法。这对造纸废水的处理与PHA合成与应用推广有很重要的意义。

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